Nel Quattrocento, il feudo di Ariccia apparteneva all'Abbazia di Santa Maria di Grottaferrata, come testimoniato da numerosi atti notarili dell'epoca. Il borgo tuttavia era spopolato, tanto che in un atto notarile del 1428 viene addirittura menzionato come tenimentum Castri diruti Vallis Ariciae. Il 19 ottobre 1473 il cardinale Giuliano Della Rovere, abate commendatario dell'Abbazia di Grottaferrata, permutò il feudo di Ariccia con Mariano Savelli, in cambio del Borghetto di Grottaferrata, fortificazione situata al X miglio della via Anagnina. In questo periodo iniziò la ricostruzione di Ariccia, poiché i Savelli si erano impegnati "ad costruendum [castrum Ritiae], aedificandum, reparadum": la popolazione tornò a crescere, tanto che nel 1597 il cardinale vescovo della sede suburbicaria di Albano Michele Bonelli contò ad Ariccia 800 abitanti, ovvero una popolazione superiore a quella della vicina -ed oggi considerevolmente più popolosa- città di Albano Laziale.

Alla fine del Cinquecento la venerazione del popolo di Ariccia verso la Madonna di Galloro era così sentita che nel 1594 Artemisia Savelli, moglie del duca Mario Savelli, essendo affetta da una malattia fece voto di far costruire attorno all'immagine una cappella in pietra; tuttavia i canonici della Collegiata, proprietari del terreno, si opposero a questo proposito non appena seppero che la duchessa avrebbe apposto sulla cappella lo stemma dei Savelli. In seguito a questo episodio disdicevole, il canonico ariccino Gian Pietro Arzani in una memoria minuta riportata dal Lucidi ipotizza che la devozione popolare verso l'immagine sia andata progressivamente scemando, fino a scomparire del tutto in ambito locale all'inizio dei Seicento.

Il "primo devoto" della Madonna di Galloro, considerato a tutti gli effetti il suo "ri-scopritore", fu un bambino di origine toscane, tale Sante Bevilacqua, che nel marzo 1623[15] -o nel marzo 1621 secondo altri storici[16]- avrebbe scoperto nel fosso tra Monticella piccola e Monticella grande l'immagine in abbandono, mentre andava cercando luppoli per le campagne.

In seguito ad alcuni eventi miracolosi attribuiti alla Madonna di Galloro, il canonico ariccino Polidoro Polidori, originario di Frascati, maturò l'intenzione di consacrare una cappella alla Madonna di Galloro, che era posta nel luogo originario dove era ubicata l'immagine[17][15]. Pertanto il 3 maggio 1623 la cappella venne inaugurata, con una solenne processione di fedeli provenienti non solo da Ariccia ma anche dai Castelli Romani circostanti: il custode della cappella fu don Francesco Barzante, mentre Sante Bevilacqua, "scopritore" della sacra immagine, si offerse spontaneamente come chierico.

Assieme al grande afflusso di pellegrini presso la cappella, si ebbe anche un grande afflusso di lasciti e di elemosine rendendosi pertanto necessario istituire l'ufficio di un depositario delle offerte: il primo fu Ottavio Vanni, arcidiacono della basilica cattedrale di Albano: questi raccolse in cassa in breve tempo ben 36.000 scudi, con i quali si pensò di realizzare una dignitosa chiesa dedicata alla Madonna di Galloro.

Il cardinale vescovo della sede suburbicaria di Albano Giovanni Battista Deti pose la prima pietra del nuovo santuario di Santa Maria di Galloro il 15 agosto 1624.

Correndo la Quaresima dell'anno 1631, padre Benigno Bracciolini, monaco vallombrosano, predicava nella basilica cattedrale di San Pancrazio, proprio mentre si andava delineando il proposito di affidare la gestione del costruendo santuario ad un ordine religioso. Tale gestione, unitamente all'autorizzazione di stabilirsi in loco venne concessa ai frati vallombrosani grazie alla protezione del cardinale Carlo di Ferdinando de' Medici e con l'assenso del cardinale vescovo della sede suburbicaria di Albano Gaspar de Borja y Velasco e del principe Paolo Savelli, il 4 dicembre 1631 Tuttavia, poiché la terra su cui era stata edificato il nuovo santuario e la vigna su cui doveva essere edificato il convento erano a tutti gli effetti di proprietà della Collegiata di Ariccia, il principe Paolo Savelli da parte sua si impegnò a cedere ai canonici regolari ariccini un altro terreno equivalente situato altrove, mentre il cardinale vescovo Gaspar de Borja ottenne che i vallombrosani pagassero 500 scudi al capitolo e gli consegnassero una certa parte dei diritti sulle sepolture all'interno della chiesa conventuale, «per qualunque pretensione, o interesse, che [il capitolo] vi possa avere». Ad ogni modo, l'arciprete ed i canonici di Ariccia non si opposero all'espropriazione di ciò che era loro di diritto per rispetto all'autorità del vescovo; paradossalmente, non furono neppure consultati al riguardo. I lavori per la costruzione del convento iniziarono il 17 gennaio 1632: il primo abate di Galloro fu proprio padre Benigno Bracciolini, che si era massimamente impegnato per l'apertura di questo convento: la sua nomina venne ratificata da papa Urbano VIII con Breve apostolico del 30 maggio 1632.
Domenica 15 maggio 1633, giorno di Pentecoste, venne consacrata la nuova chiesa del santuario: Demetrio Masseroni scrisse il giorno stesso della solenne cerimonia una memoria dell'evento per il principe Bernardino Savelli, che viene così riassunta da Giuseppe Boerio nella sua opera sul santuario di Galloro:

    « Ai 15 di maggio del 1633, cadendo la prima feste di Pentecoste, la confraternita d'Ariccia venne in processione alla cappella della Vergine, dove il P. Bracciolini,  stava aspettandola in abito pontificale. Recitate alcune brevi orazioni avviaronsi in bell'ordine alla nuova chiesa e, fermatisi davanti alla porta, il P. abate co' suoi ministri entrò, la benedisse e dedicò sotto il titolo di Immacolata Concezione .... Indi celebrò la prima Messa solenne; e a sera i vespri con isceltissima musica. »
    
(Giuseppe Boero, Istoria del Santuario della Beatissima Vergine di Galloro, p. 23.)

Il giorno seguente, 16 maggio 1633, l'immagine della Madonna di Galloro venne solennemente traslata dal luogo della sua collocazione originaria, nel fosso tra la Monticella piccola e la Monticella grande, alla nuova chiesa appena consacrata[25]: alle ore tredici partì la processione, a cui prese parte il clero di Ariccia con la confraternita e il capitolo, undici confraternite provenienti da tutta la sede suburbicaria di Albano e dalla sede suburbicaria di Frascati, e i religiosi vallombrosani:
    
« Ridevan le strade d'ogni varietà di fiori, risonava l'aria di voci e strumenti, e i campi e le valli formicolavan di popolo.  Ma il meglio a vedersi era la terra dell'Ariccia messa in apparecchio di festa. Le vie tramezzate a luogo a luogo da archi trionfali, le porte delle case addobbate a festoni e fregi, e giù pendenti dalle finestre arazzi, tappeti, zendadi finissimi a partite di varii colori, avendo ognuno fatto a chi può più mettere in veduta quanto di prezioso e di bello aveva. »
    
(Giuseppe Boero, Istoria del Santuario della Beatissima Vergine di Galloro, p. 24.)